2月9日，清华大学医学院郭永团队与北京大学第一医院、首都医科大学附属北京妇产医院合作，在国际著名学术期刊《分析化学》（Analytical Chemistry）发表了题为“用于脊髓性肌肉萎缩症分子诊断和疾病严重程度评估的单管多重数字聚合酶链式反应检测方法”（Single-Tube Multiplex Digital Polymerase Chain Reaction Assay for Molecular Diagnosis and Prediction of Severity of Spinal Muscular Atrophy）的文章，并被选为杂志封面。脊髓性肌萎缩症（Spinal muscular atrophy，SMA）是儿童最常见的遗传性神经肌肉病，目前用于SMA相关基因检测和拷贝数确定的方法复杂、耗时或无法同时检测多个靶标。本研究基于数字PCR技术建立了能够在单管完成运动神经元存活基因1（SMN1）外显子7和8与运动神经元存活基因2（SMN2）外显子7和8拷贝数检测的方法，具有准确、快速、操作简单、样本用量少和适用于多种类型样本的优势，为SMA的分子诊断、大规模筛查和疾病严重程度评估提供了一个有力的工具。

文章被选为《分析化学》杂志封面

　　2021年12月，国家医保局公布一批新药进医保，全球首个用于治疗SMA的高价药物——诺西那生钠注射液名列其中，罕见病SMA也因此受到大众关注。SMA是一种严重的神经肌肉疾病，其特征是脊髓前角α-运动神经元的退化变性，导致近端肌肉逐渐无力、萎缩和瘫痪，发病率约为1/10000，人群携带率约为1/50，是导致新生儿死亡的重要遗传因素之一。SMA是一种常染色体隐性遗传病，95%的患者是由于SMN1基因7号外显子纯合缺失而致病（大部分SMN1基因8号外显子共同缺失）；另一个与SMN1高度同源的基因SMN2已被证实与疾病严重程度相关，SMN2的拷贝数在治疗与用药中被作为重要参考数据。因此，精准的检测出SMN1和SMN2的拷贝数对于临床疾病诊断、携带者筛查、疾病严重性预测评估、治疗和预后至关重要。

图1基于数字PCR的SMA检测流程

　　本研究建立了一种基于数字PCR单管检测SMN1外显子7和8、SMN2外显子7和8及内参基因的方法，通过数字PCR技术绝对定量目标基因和内参基因的模板拷贝数，计算目标基因与内参基因模板拷贝数的比值来实现目标基因拷贝数的检测（图1）。作者以不同的荧光染料标记五个基因的探针，并配合新羿生物的五色微液滴数字PCR系统进行检测，实现了五个基因单管检测。此外，为了能够区分高度同源的SMN1和SMN2基因（在外显子7和外显子8上各只有1个碱基的差异），作者使用了小沟结合物（Minor groove binder，MGB）和锁核酸（Locked nucleic acid，LNA）对检测探针进行修饰。

图2不同类型的临床样本的SMN1和SMN2检测结果分布（TGR：Target gene ratio,目标基因与内参基因模板拷贝数的比值）

　　为了验证方法的准确性，作者收集了共317例不同类型的临床样本进行检测，包括外周血、羊水、绒毛、口腔拭子和干血斑。在317例样本中，共有22例患者、72例携带者和223例正常人（图2），结果显示该方法对于不同类型的样本都能够实现目标基因拷贝数准确的检测。此外，作者也观察到了SMN2基因拷贝数更多的SMA患者具有更轻的表型；通过对目标基因的同时检测，亦观察到患者、携带者和正常人群中都出现基因转换而产生融合基因的情况。

　　与现有的检测方法如限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）和荧光定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）相比，本方法能精准检测更多靶标，且对模板量要求低（≥1.5ng）；与金标准方法多重连接探针扩增（Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）相比，本方法检测周期更短（首次出结果24hvs，2.5h）、操作更简单、对模板量的要求低和适用于更多种类型样本。

　　本工作研发了基于数字PCR技术的SMA精准检测方法，能够在单管完成SMN1外显子7和8与SMN2外显子7和8拷贝数的检测，具有检测准确、检测快速、操作简单、检测限低和适用于多种类型样本的优势，为SMA分子诊断、大规模筛查和疾病严重程度评估提供了一个有力的工具。

　　清华大学陈芊如与首都医科大学附属北京妇产医院闫有圣为该研究的共同第一作者，清华大学郭永与北京大学第一医院马祎楠为该研究的共同通讯作者。该研究得到了科技部国家重点研发计划、清华大学春风基金和国家自然科学基金委青年科学基金的联合资助。