华东师范大学李大力课题组经过两年多的艰苦攻关，研发出系列超高活性胞嘧啶碱基编辑器（hyCBE），这一系列新的基因编辑技术针对碱基突变引起的遗传疾病，展示出基因治疗的巨大潜力。该研究于5月11日在国际著名学术期刊Nature Cell Biology发表。

　　“这一组碱基编辑系列新工具，在实现更高编辑效率和更宽编辑窗口的同时，仍然保持了其精准的工作性能。”课题组首席科学家李大力说。

课题组李大力研究员（右）博士研究生张晓辉

　　同期发布期刊评论中，美国威尔康奈尔医学院癌症生物学家以《Base editing goes into hyperdrive》为题，指出这项 “‘超级编辑器’为疾病建模和基因治疗提供了有效工具。”评论认为，李大力实验室的工作丰富了BE工具箱，扩展了应用范围，并证明了这些新工具具备更高效率和更宽范围的碱基突变能力，在动物疾病模型中精确的错义突变也显示其治疗潜力。

　　“新型超级编辑器除了可应用于模型制作和疾病治疗，还可以帮助我们提高BE工具技术性改造的认知以及获取决定编辑效率的因素，这将为新工具研发提供合理性的设计指导，进一步推动基础研究和临床转化的发展进程。”该评论文章说。

杂志highlight评论 《Base Editing Goes Into Hyperdrive》

　　活性百倍激升 精确构建遗传疾病动物模型

　　该研究将Rad51蛋白的单链DNA结合结构域融合到Cas9与脱氨酶之间，极大地提高了胞嘧啶碱基编辑器（CBE）的编辑活性，拓宽编辑窗口，因此将其命名为超高活性CBE（hyBE4max）;类似地还改造出具有更宽的编辑窗口和更高活性的hyA3A-BE4max，以及能更高效识别TC碱基模块中的C（胞嘧啶）而不引起其他C突变的hyeA3A-BE4max。

　　“以hyeA3A-BE4max为例，在所检测的靶点中，特定位点的编辑活性最高提高了257倍。”李大力说，“通过胚胎显微注射，能在胚胎中精确改变单个碱基，直接获得杜氏肌营养不良（DMD）小鼠模型，平均效率提高了近60倍。”

　　除了能快速精确构建遗传疾病动物模型，hyeA3A-BE4max在β地中海贫血的治疗中也展现了显著的优势，实现真正单个碱基的突变，体外实验证明有更好的治疗效果。一系列严格的实验表明，这一新编辑器具有非常高的精确性，没有检测到明显的DNA和RNA脱靶，证明了新编辑工具用于基因治疗的巨大潜力。

　　华东师大团队在基因治疗领域发力前行

　　近年欧美国家已陆续批准了治疗腺苷脱氨酶（ADA）缺乏性重度联合免疫缺陷症、脊髓性肌萎缩症、β地中海贫血和莱伯氏先天性黑蒙症等遗传病的基因治疗药物。由于技术限制，已上市的药物存在不能长期有效或者诱发肿瘤的风险，因此科学家们不断开发新的基因改造的技术，期望能够克服现有技术的不足，实现一次治疗终身治愈。

前排左一为张晓辉，左三为陈亮，后排左二为朱碧云

　　以2012年发明的CRISPR/Cas9系统为代表的基因编辑技术是近年来最为火热的分子生物学技术之一。华东师大生命科学学院刘明耀、李大力课题组在2013年在国际上率先建立了大鼠和小鼠胚胎的Cas9基因编辑技术，将基因修饰动物构建的时间由传统方法的18个月缩短到5周左右，解决了基因治疗研究中必不可少的疾病模型构建的问题。随后利用Cas9技术修复了动物模型中的单个碱基突变，治愈了B型血友病，证明其在遗传疾病治疗中的潜力。然而，Cas9技术精确修复碱基突变的效率非常低，只有1%左右，很难在更多的疾病治疗中推广。

　　2016年美国科学家开发的CBE技术，能在不产生DNA双链断裂的前提下，直接将目的片段一定范围内的胞嘧啶转化成胸腺嘧啶，实现C/G碱基对向T/A碱基对的转换。今年年初，华东师大团队发表论文，成功地利用CBE技术建立了人类造血干细胞单碱基编辑技术体系，证明CBE有治疗β地中海贫血的潜力，但存在编辑效率偏低、精准度有限等阻碍临床应用的问题。

　　“我们研发的超高活性碱基编辑技术基本解决了上述问题，有望成为遗传疾病治疗的首选碱基编辑器。”李大力说。

　　据介绍，华东师大生命科学学院博士研究生张晓辉，硕士研究生陈亮和博士研究生朱碧云为该研究的共同第一作者，华东师范大学为第一作者单位，李大力教授为本文通讯作者，刘明耀教授对本课题给予了悉心指导。该研究受到了科技部重点研发计划、国家自然科学基金以及上海市教委重大项目等经费的支持。

　　延伸阅读

　　5月11日，华东师大生命科学学院李大力课题组在国际著名学术期刊Nature cell Biology发表了题为《Increasing the efficiency and targeting range of cytidine base editors through fusion of a single-strand DNA binding protein domain》的研究论文，介绍了课题组最近开发的超高活性胞嘧啶碱基编辑器（hyCBE）。该碱基编辑新工具的开发，有望为基因治疗提供自主研发的新工具，提升遗传疾病基因疗法精准性和长效性。

　　据ClinVar 数据显示，人类的遗传病中58%是由于单个碱基突变引起的。虽然Cas9激活的同源重组可以实现对突变位点的精确修正，但效率非常低（0.1%~5%），严重阻碍了其应用。而通过将胞嘧啶脱氨酶与nickase Cas9（D10A）融合而成的胞嘧啶碱基编辑器BE3（Cytosine base editor, CBE）, 在不引入DNA 双链断裂同时也不需要重组修复模板的情况下对编辑窗口（距离PAM远端起的第4-7位）内的胞嘧啶脱氨，实现C>T的碱基转换，具有更加安全、高效、精准的特点，在基因治疗，农作物遗传育种，药物筛选等领域展示了广泛的应用前景。自CBE被发明以来，多种策略对其进行了优化改进，虽然这些方法一定程度上提高了CBE的活性，但是对于编辑窗口的影响不大，特别是更靠近PAM序列的碱基仍然很难被编辑到。因此，是否有新的策略可以提高编辑活性而又能扩增靶向碱基的范围，一直是碱基编辑器优化的难点。

　　由于CBE主要是以单链DNA（ssDNA）为底物，因此研究团队猜测如果增强脱氨酶与ssDNA的结合能力，是否能增加脱氨酶作用时间而增强活性呢?于是，通过对10个非序列特异性的ssDNA结合结构域（ssDBD）与CBE进行融合，通过筛选，发现将Rad51蛋白的ssDBD融合到APOBEC1与Cas9n之间能显著提高碱基编辑活性，同时编辑窗口也大幅增加（图1）。通过10个靶点的分析，在编辑窗口C4-C8中，hyBE4max比BE4max活性提高了1.5-2倍，而在C9-C15这些更靠近PAM的碱基中，活性最多提高了18倍。

图1. hyCBE模式图及对不同ssDBD的筛选结果

　　为了验证融合ssDBD的策略是否具有通用性，用类似的方法改造A3A-BE4max和特异性识别TC motif中C碱基的eA3A-BE4max, 获得了hyA3A-BE4max 和 hyeA3A-BE4max。通过大量的实验证明，相比A3A-BE4max，hyA3A-BE4max活性在C3-C11位点提高了1.2-2倍，C12-C17位点活性提高3-4倍，通过小鼠胚胎显微注射也进一步证明其在编辑更靠近PAM序列的碱基的独特优势。与eA3A-BE4max 相比，hyeA3A-BE4max任然能非常特异性地靶向TC motif中的C，编辑窗口由C4-9拓展为C4-15，活性最高提高了 257倍，而在小鼠胚胎中在C13位的编辑活性也提高了近60倍，F0代小鼠获得DMD纯合点突变的效率达到40%。

　　论文进一步验证hyCBEs特别是hyeA3A没有检测到DNA或者RNA层面的脱靶，具有非常高的精准性。最后，通过比较多种CBE在编辑胎儿血红蛋白（HBG1/2）启动子-117位点的能力发现，hyeA3A能在红细胞前体细胞系中精确催化-117G>A的转换，而周围同时发生碱基突变（by stander mutation）的细胞相比，具有更高的HBG表达水平，展示了 hyeA3A-BE4max 对于精准治疗β-血红蛋白病的巨大潜力。该工作开发了能提高编辑活性拓宽靶点范围的一些列新的CBE，为基础研究与基因治疗提供了新的优化工具。

　　华东师大生命科学学院博士研究生张晓辉，硕士研究生陈亮和博士研究生朱碧云为该论文的共同第一作者，华东师范大学为第一作者单位，李大力教授为本文通讯作者，刘明耀教授对本课题给予了悉心的指导，同济大学毛志勇教授课题组在实验室提供了重要支持，该研究受到了科技部重点研究发计划、国家自然科学基金以及上海市教委重大项目等经费的支持。